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金黃色葡萄球菌檢驗標準要點解析

注意事項:菌株僅用於實驗、科學研究,不可用於人類或動物的臨床診斷或治療,非藥用,非食用。

第一法 金黃色葡萄球菌定性檢驗

1、7.5%氯化鈉肉湯增菌培養:

(1)若樣品本身在均質後清澈,培養18h觀察呈現一定程度的渾濁(與培養前相比),則接種平板;若18h後仍無變化,繼續培養至24h後無論渾濁與否都接種至平板;

(2)若樣品本身在均質後渾濁,則直接培養至24h後再接種平板。

2、血平板:

36±1℃培養18h後觀察,若有菌落生長或有菌落生長的跡象(無論是否溶血),則應酌情配製NA、BHI並分裝至小試管中(NA 10mL/管、BHI 5mL/管)、滅菌後NA應斜放凝固成瓊脂斜麵備用。至血平板培養至24h取出,挑取菌落進行革蘭氏染色鏡檢,同時挑取菌落接種至NA斜麵、BHI肉湯管,36±1℃培養24h。

3、接種原則:

(1)革蘭氏染色後還剩餘10個或10個以上菌落,則NA、BHI分別接種5管;

(2)若多於5個(不包括5個)不足10個,則BHI接種5管,剩餘的接種NA;

(3)5個及以下則全部接種BHI,不接種NA。

4、BP平板:

36±1℃培養24h後觀察,有菌落生長則取出,無菌落生長則繼續培養至48h後再觀察。若血平板已挑取菌落進行證實試驗,則不必再挑取BP平板上的菌落進行實驗。 若血平板上無菌落生長,則應在24h~48h內逐步觀察BP平板是否長菌或有無長菌跡象,有則需配置BHI及NA,挑取BP上的菌落進行純化、增菌,36±1℃培養24h。

5、血漿凝固酶試驗:

(1)根據BHI管數,取凍幹血漿粉,每瓶用移液槍加入0.5mL生理鹽水,使其充分溶解,再換移液槍槍頭取0.3mLBHI培養物加入其中(每管BHI用1個槍頭),振蕩搖勻後於36±1℃培養,計時,每30min觀察一次,如呈現凝固(將試管傾斜或倒置時出現凝塊)或半凝固(一般的液體呈現凝固)則判定為陽性。若一直不凝固,則一直觀察,直至觀察至6h(查看12次)還未凝固,則試驗終止,判定為陰性結果;若中途出現完全凝固或半凝固,則試驗終止,判定為陽性結果。

(2)同時取金黃色葡萄球菌標準菌株(ATCC 6538以及CMCC(B)26003各一支)製成菌懸液後作為陽性對照、以滅菌生理鹽水為陰性對照,分別接種至BHI中同步培養後進行血漿凝固酶試驗。

(3)若血漿凝固酶試驗結果可疑,則挑取NA上的菌落接種BHI再次進行試驗。

第二法 金黃色葡萄球菌平板計數法

1、取1mL樣品稀釋勻液接種3個BP平板(此處並未嚴格按照標準中0.3mL、0.3mL、0.4mL精確取樣,由於如此操作會增加試驗時間,無法在15min內完成試驗)。

2、塗布時不要觸及平板邊緣(會導致樣液塗抹不均勻,大部分匯集於邊緣)。

3、可用同一根塗布棒從低稀釋度到高稀釋度進行塗布(不用換塗布棒)。

4、塗布完成後應稍微放置一段時間使培養基吸收樣品勻液。

5、若水珠較多,可正置於培養箱中1~2h後再倒置培養。

6、36±1℃培養24h後觀察,有典型菌落生長則進行證實試驗(革蘭氏染色鏡檢、血漿凝固酶試驗、劃線血平板)。若無菌落生長則繼續培養至48h後再觀察,有典型菌落生長則進行證實試驗,無典型菌落生長則試驗終止。

第三法 金黃色葡萄球菌MPN計數法

1、樣品稀釋同菌落總數,取3個連續稀釋度稀釋液(或包括液體樣品原液),每個稀釋度接種3管7.5%氯化鈉肉湯,每管接種1mL,36±1℃培養18h後觀察,若出現渾濁則接種至BP平板,若無變化則繼續培養至24h後再接種至BP平板。

2、劃線接種至BP平板,36±1℃培養24h後觀察,有典型菌落生長則進行證實試驗(革蘭氏染色鏡檢、血漿凝固酶試驗、劃線血平板)。若無菌落生長則繼續培養至48h後再觀察,有典型菌落生長則進行證實試驗,無典型菌落生長則試驗終止。

3、根據證實後的陽性管數差MPN表得出結果。

GB 4789.4-2016 食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 沙門氏菌檢驗

(標準補充)

1、稱取25g樣品於可封口的均質袋中,再倒入BPW至250g,盡量排去均質袋中的空氣後再封口、均質後直接置於36±1℃培養箱中培養過夜(標準要求為8~18h,一般培養過夜後第二天早晨繼續下一步試驗)

2、TTB、SC應酌情配製,現配現用,不宜久置。若BPW放入培養箱的當日時間允許,則可將TTB、SC滅菌、配製、分裝後冷藏以備第二天實驗;若當日時間不允許,則次日早晨滅菌、分裝,下午即可轉接培養。

3、TTB:滅菌條件為121℃15min,與一般試驗耗材、培養基的滅菌條件一致,故在滅菌時可考慮同時滅為一鍋。且須同時滅一些帶塞(可帶塑料蓋子)的小試管、10mL移液槍槍頭、1mL移液槍槍頭,在滅菌完成後溫度降至不燙手時,輕輕晃動三角燒瓶使底部白色沉澱物浮起而充分混勻,每100mLTTB中加入1支碘液(陸橋,P-72)、1支0.1%煌綠(陸橋,P-73),充分搖勻至整瓶TTB呈現綠色,此時用移液槍準確吸取10mLTTB至已滅菌的小試管中,蓋上蓋子。取1mLBPW增菌液至1管TTB中,於42℃培養18~24h(若時間允許、或18h後觀察試管仍無渾濁,則培養至24h,否則培養至18h即可)。

4、SC:僅需加熱煮沸滅菌(因SC易溶於水,煮沸即可,無需過度加熱),冷卻至不燙手時用移液槍吸取10mL分裝至已滅菌的小試管中,蓋上蓋子。取1mLBPW增菌液至1管SC中,於36±1℃培養18~24h(若時間允許、或18h後觀察試管仍無渾濁,則培養至24h,否則培養至18h即可)。

5、BS、XLD應酌情配製,在用前一天配製後備用(兩者僅需加熱滅菌、不添加任何添加劑,無需過度加熱)。BS在不燙手時即可倒成平板,否則容易沉澱或凝固,且在倒平板前應充分搖勻以防止有效成分沉澱於底部(棕色或棕黃色顆粒物)。XLD過度加熱會造成瓊脂不易凝固、劃線時容易劃破,甚至不凝結成塊、無法倒置。

6、XLD培養條件:36±1℃培養18~24h。18h後觀察,若TTB、SC增菌液都有菌落生長,則可挑取任意生長良好的菌落進行生化鑒定試驗;若隻有其中一種增菌液有菌落生長、或兩者都無菌落生長,則繼續培養至24h再觀察,此時無論菌落生長與否都不再繼續培養,隻要其中任一增菌液有典型或可疑沙門氏菌生長則挑取進行生化試驗。

7、生化鑒定:

(1)一般情況下,XLD上的任一增菌液長菌,則BS上對應增菌液也會長菌,此時若已挑取XLD上的菌落進行生化試驗,則無需挑取BS上的菌落;或XLD上的兩種增菌液長了形態特征完全相同的菌落,則挑取任一典型菌落進行生化鑒定即可,且無論BS上菌落生長如何,都不再挑取BS上的菌落進行生化試驗。

(2)若出現XLD未長菌的增菌液在BS上長菌,則還需挑取BS上的該菌落進行生化試驗。

(3)用生化鑒定試劑盒進行生化鑒定,依據產品說明書判斷陰性或陽性,再根據標準中表2~表5的內容逐步進行判定(即生化鑒定試劑盒是將標準中的所有鑒定步驟同時完成,但判定時依然要按照標準逐步判定,隻要其中任一階段可判定為非沙門氏菌屬,則不再往下判定,鑒定試驗即終止)

(4)若判定為沙門氏菌屬,則可選擇進行或不進行血清凝集試驗。首先應確定該菌落無自凝性,否則無法進行血清學試驗。

本文轉載自微信公眾號食品微生物檢測。